P421-424 Nhà E1 - Khu Ngoại Giao Đoàn Trung Tự, Số 6 - Đặng Văn Ngữ, P. Trung Tự, Q. Đống Đa, TP. Hà Nội.
Nguyên liệu thực phẩm chức năng, Dược phẩm và Mỹ phẩm, Dịch vụ Đăng ký công bố Thực phẩm chức năng, đăng ký Mỹ phẩm, đăng ký Quảng cáo và Dịch vụ kiểm nghiệm, Gia công thực phẩm chức năng, mỹ phẩm
Website: http://novaco.vn
CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM NOVACO
30/9/2022
Posted by: Admin

Đánh giá khả năng sinh tổng hợp đường trehalose của một số chủng vi khuẩn

TÓM TẮT ĐÁNH GIÁ:

Trehalose là một loại đường đôi không khử với cấu trúc và đặc tính hóa học tương tự với đường sucrose, thường được tìm thấy trong tự nhiên ở một số sinh vật có khả năng chống chịu lại điều kiện môi trường khắc nghiệt. Với đặc tính ổn định, chịu nhiệt, chịu axit và không có tính khử, trehalose được ứng dụng để duy trì và bảo quản các loại phân tử sinh học.

Hướng ứng dụng rộng rãi nhất của loại đường này là trong ngành công nghiệp thực phẩm với mục đích bảo quản và duy trì chất lượng của thực phẩm. Ngoài ra trong nghiên cứu y dược, trehalose được dùng như một chất bảo vệ tế bào, ổn định protein, bảo vệ mô và cơ quan. Trong tự nhiên có nhiều con đường sinh tổng hợp trehalose.

Báo cáo này nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp trehalose nội bào của một số chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Công nghiệp Thực phẩm, đồng thời xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp trehalose. Kết quả đánh giá cho thấy chủng vi sinh vật FIRI 181712 có thể tổng hợp được trehalose với hàm lượng lên đến 12,617 (mg/g sinh khối ướt) trong điều kiện môi trường nuôi cấy chứa 2% (w/v) maltodextrin, 4% (w/v) NaCl, cấp giống 5% (v/v) ở 300C trong 4 ngày.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Đường trehalose (α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside) là một đường đôi không khử, cấu tạo từ hai phân tử glucose gắn với nhau bởi liên kết α,α-1,1-glycosid. Trehalose tồn tại dưới dạng bột tinh thể không màu, khối lượng riêng lý thuyết là 1,511 g/cm3 [3]. Đường trehalose tan trong nước nhưng không tan trong cồn. Độ tan trong nước (ở 200C) khi ở dạng khan và dạng tinh thể ngậm nước lần lượt là 43,03 g/100 ml dung dịch và 46,63 g/100ml dung dịch [1]. 

Trehalose là một trong những loại đường ổn định nhất, có khả năng chịu nhiệt cao, lên đến 99% ở 1200C trong 90 phút.

Trehalose thường được tìm thấy trong các sinh vật có khả năng chống chịu lại điều kiện ức chế từ môi trường, ví dụ như côn trùng, vi khuẩn, nấm men, một số loài động vật không xương sống như giun tròn, tôm biển… Trehalose có mặt trong tế bào nhiều loài vi khuẩn, bao gồm Streptomyces hygroscopicus [5], Mycobacterium smegmatis và tuberculosis [4]. Trehalose còn được phát hiện trong Escherichia coli và một số lượng lớn các loài vi khuẩn khác như Rhizobium sp. [7], Sulfolobus acidocaldarius [8], Arthrobacter sp. Q36 [6],… Khi bổ sung một vài tác nhân gây ức chế vào môi trường sống của vi sinh vật như NaCl, đường glucose, đường maltose…

Với mục đích làm thay đổi cân bằng áp suất thẩm thấu, khiến màng tế bào bị co nguyên sinh trong môi trường ưu trương; hoặc gây sốc nhiệt vi sinh vật, gây mất nước tế bào, cũng có thể kích hoạt khả năng sinh tổng hợp trehalose ở một số vi sinh vật. Nhằm phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp trehalose làm tiền đề cho nghiên cứu sinh tổng hợp đường trehalose bằng con đường sinh học, trong báo cáo này, khả năng sinh tổng hợp trehalose của một số chủng vi sinh vật được nghiên cứu trong một số điều kiện nuôi cấy có tác động của một số yếu tố ức chế nhất định. 

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

Bộ chủng vi khuẩn do Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp, bao gồm: FIRI 181712; FIRI 186091; FIRI 181688; FIRI 186889 và FIRI 189168. 

Những chủng này được phân lập từ rễ cây lạc và bảo quản trong thạch nghiêng ở 40C rồi nuôi hoạt hóa ra 10ml môi trường LB lỏng ở 300C trong 24 giờ. Tiếp tục cấy chuyền chủng ra LB lỏng từ 2 đến 3 lần. Giống lỏng sau đó được cấy ria trên đĩa Petri chứa môi trường LB thạch để hình thành khuẩn lạc. Khuẩn lạc của các chủng được chọn lựa để nuôi cấy trong 10ml LB ở 300C qua đêm. Dịch nuôi cấy được dùng để tiếp giống với tỉ lệ 1% (hoặc tỷ lệ nhất định của từng thí nghiệm) sang bình tam giác 250ml có chứa 99 ml môi trường phù hợp cho sinh tổng hợp trehalose. 

2.2. Phương pháp khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy

Vi khuẩn sau khi hoạt hóa được cấp giống 1% (hoặc tỷ lệ nhất định của từng thí nghiệm) vào môi trường LB lỏng có bổ sung glucose, maltose, maltodextrin và NaCl (với nồng độ nhất định của từng thí nghiệm) để tạo nên môi trường ức chế thúc đẩy quá trình tổng hợp nên trehalose. Ngoài ra dịch nuôi cấy được đặt trong các điều kiện tỷ lệ cấp giống, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy khác nhau để nghiên cứu sự ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp đường trehalose. 

2.3. Phương pháp thu nhận trehalose nội bào

Dịch nuôi cấy thu được (100ml) được ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 15 phút ở 40C để thu tế bào. Độ ẩm của sinh khối ướt của chủng FIRI 181712 thu được sau khi ly tâm là 80,5 ± 1,2% (phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở 103 ± 20C). Bổ sung 2ml đệm phosphate 7, rồi tiến hành phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong 5 chu kỳ × 30 giây. Dịch sau siêu âm được ly tâm 4500 vòng/phút, 40C trong 15 phút thu dịch nội bào có chứa trehalose. 

2.4. Phương pháp định lượng trehalose

Hàm lượng trehalose trong mẫu sau khi xử lý từ canh trường được xác định bằng kit trehalose K-TREH 07/17 (Megazyme) dựa trên nguyên tắc và quy trình của hãng khuyến cáo. Các số liệu hàm lượng trehalose (biểu diễn theo 100ml dịch nuôi cấy hoặc 1 g sinh khối ướt) là số liệu trung bình của 3 thí nghiệm lặp lại, các thanh sai số biểu diễn giá trị SD của các giá trị hàm lượng trehalose. 

III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp trehalose của một số chủng vi khuẩn

Năm chủng vi khuẩn FIRI 181712; FIRI 186091; FIRI 181688; FIRI 186889 và FIRI 189168 được nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp trehalose trong một số môi trường LB cải tiến dưới đây: MT1: môi trường LB bổ sung thêm 2% glucose; MT2: môi trường LB bổ sung thêm 1% glucose và 1% maltose; MT3: môi trường LB bổ sung thêm 1% glucose và 1% maltodextrin; MT4: môi trường LB bổ sung thêm 1% NaCl; MT5: môi trường LB trong điều kiện 600C; MT6: môi trường LB bổ sung 1% NaCl và tiếp giống tỉ lệ 10%. Kết quả được thể hiện trong Bảng 1: Chủng vi khuẩn FIRI 181712 có khả năng tổng hợp được trehalose với hàm lượng lớn nhất trong 5 chủng khảo sát, trong môi trường nuôi cấy chứa 1% glucose; 2% maltodextrin; 2% NaCl; 0,5% cao nấm men; 1% peptone; 0,4% glycerol. Vì thế, trong các nghiên cứu tiếp theo, chủng vi khuẩn này được lựa chọn để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của cơ chất maltodextrin, maltose, NaCl và các điều kiện nuôi cấy như tỷ lệ cấp giống, nhiệt độ và thời gian để tìm ra những điều kiện thích hợp nhất cho tổng hợp trehalose. 

3.2. Ảnh hưởng của nồng độ maltose và maltodextrine đến tổng hợp trehalose của chủng FIRI 181712

Maltose và maltodextrin đóng vai trò là nguồn carbon sử dụng cho sự tăng trưởng của vi khuẩn. Theo Low (1985), khi bổ sung NaCl vào môi trường, nồng độ chất tan bên ngoài môi trường cao hơn so với bên trong tế bào, sự chênh lệch áp suất thẩm thấu khiến cho lượng nước trong tế bào vi sinh vật thẩm thấu qua màng, gây co tế bào. Trehalose được vi sinh vật tổng hợp dưới điều kiện ức chế thẩm thấu để duy trì tính bền của màng lipid nhờ lực liên kết hydro [2]. 

Mặt khác, maltose và maltodextrin lần lượt là cơ chất của phản ứng tổng hợp trehalose từ enzyme trehalose synthase và MTHase, MTSase. 

Tiến hành thí nghiệm với nồng độ nguồn dinh dưỡng cacbon (maltodextrin hoặc maltose thay đổi từ 1-5% (w/v)) ở môi trường có nồng độ NaCl 2% (w/v), tỷ lệ cấp giống 10 % (v/v), nhiệt độ 300C, thời gian nuôi cấy 2 ngày, kết quả thu được như trình bày trên Hình 1. Hàm lượng trehalose cao nhất khi bổ sung 2% (w/v) maltodextrin vào môi trường nuôi cấy (Hình 1). 

3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến tổng hợp trehalose của chủng FIRI 181712

Tiến hành thí nghiệm với nồng độ NaCl thay đổi từ 1,0-6,0% (w/v), hàm lượng maltodextrin 2% (w/v), tỷ lệ cấp giống 10 % (v/v), nhiệt độ 300C, thời gian nuôi cấy 2 ngày, thu được kết quả như trình bày trên Hình 2. 

Trong thí nghiệm này, quá trình ức chế thẩm thấu do nồng độ muối cao đã kích thích vi sinh vật tổng hợp trehalose để bảo vệ tế bào chống lại sự mất nước. Tuy nhiên hàm lượng trehalose tạo ra không tỉ lệ thuận với nồng độ NaCl bổ sung vào môi trường, vi sinh vật tổng hợp lượng trehalose cao nhất đạt 11,179 mg/g sinh khối ướt, khi nồng độ NaCl là 4% (w/v) (Hình 2), tiếp tục tăng nồng độ muối có thể vượt quá ngưỡng chống chịu của vi sinh vật nên sản phẩm đường tạo thành giảm đi.

3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến tổng hợp trehalose của chủng FIRI 181712

Tỷ lệ cấp giống liên quan trực tiếp tới mật độ quần thể, nếu tỷ lệ cấp giống quá cao, pha cân bằng sinh trưởng bị rút ngắn vì môi trường nhanh hết dinh dưỡng. 

Tiến hành thí nghiệm với tỉ lệ cấp giống thay đổi từ 1-20% (v/v), nồng độ NaCl 4% (w/v), hàm lượng maltodextrin 2% (w/v), nhiệt độ 300C, thời gian nuôi cấy 2 ngày, thu được kết quả như trình bày trên Hình 3. Ở mức tiếp giống 5% (v/v) phù hợp cho sự tăng trưởng và sinh tổng hợp trehalose của chủng vi sinh vật nghiên cứu.

3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tổng hợp trehalose của chủng FIRI 181712

Yếu tố nhiệt độ là tác nhân vật lý có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Sự tăng hay giảm của nhiệt độ môi trường sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ các phản ứng hóa sinh trong tế bào vi sinh vật. 

Tiến hành thí nghiệm với nhiệt độ thay đổi từ 30-450C, tỷ lệ cấp giống 10%, nồng độ NaCl 4%, hàm lượng maltodextrin 2%, thời gian nuôi cấy 2 ngày, thu được kết quả như trình bày trên Hình 4. Kết quả cho thấy nhiệt độ càng cao thì khả năng sinh tổng hợp trehalose càng giảm. Như vậy nhiệt độ nuôi cấy phù hợp nhất cho sinh tổng hợp trehalose là ở 300C.

3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp trehalose của vi khuẩn FIRI 181712

Trên cơ sở các kết quả đạt được, tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tổng hợp trehalose của chủng vi khuẩn FIRI 181712, với thời gian thay đổi từ 1-5 ngày, nhiệt độ 300C, tỷ lệ cấp giống 10%, nồng độ NaCl 4%, hàm lượng maltodextrin 2%, kết quả được trình bày trên Hình 5. 

Kết quả của thí nghiệm (Hình 5) khá phù hợp với quá trình phát triển của vi sinh vật. Thông thường, trong khoảng 2-3 ngày là pha sinh trưởng mạnh nhất, vi sinh vật sinh ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp nhất, có thể có enzyme MTHase và MTSase để chuyển hóa maltodextrin thành trehalose. Sau khoảng 72 giờ, môi trường cạn dần dinh dưỡng, trehalose được vi sinh vật tổng hợp và sử dụng như là nguồn dự trữ năng lượng, cho nên hàm lượng đường vẫn tăng lên một chút khi bước sang ngày thứ 4 rồi giảm ở ngày thứ 5.

IV. KẾT LUẬN

Trong 05 chủng vi khuẩn được cung cấp, đã tuyển chọn được chủng FIRI 181712 có khả năng sinh tổng hợp trehalose cao nhất. Đồng thời đã xác định được ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình tổng hợp trehalose của chủng tuyển chọn, cụ thể vi khuẩn FIRI 181712 tổng hợp lượng trehalose tối đa là 12,617 (mg/g sinh khối ướt) trong môi trường nuôi cấy chứa 2% (w/v) maltodextrin, 4% (w/v) NaCl, cấp giống 5% (v/v) ở 300C trong 4 ngày. 

Kết quả thu được là tiền đề cho những nghiên cứu sản xuất trehalose bằng phương pháp enzyme sau này 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bar, A. (2000). Trehalose produced by a novel enzymatic process. Dossier prepared and submitted on behalf of Hayashibara Co., Ltd., for evaluation pursuant to the EU Novel Foods Regulation (258/97) by the UK Advisory Committee on Novel Foods and Processes. 

2. Cardoso F. S., G. P., Hugenholtz J. , Ramos A., Santos H. . (2004). Enhancement of trehalose production in dairy propionibacteria through manipulation of environmental conditions. International journal of food microbiology, 91, 195-204. 

3. Crowe J. H., H. F. A., Crowe  L. M. . (1992). Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology, 54, 579–599. 

4. Elbein, A. D., Mitchell, M. (1973). Levels of glycogen and trehalose in Mycobacterium smegmatis and the purification and properties of the glycogen synthetase. J Bacteriol, 113, 863-873. 

5. Martín, M. C., Diaz, L. A., Manzanal, M. B., Hardisson, C. (1986). Role of trehalose in the spores of Streptomyces. FEMS Microbiol Lett, 35, 49-54. 

6. Maruta, K., Hattori, K., Nakada, T., Kubota, M., Sugimoto, T., Kurimoto, M. (1996). 

Cloning and sequencing of trehalose biosynthesis genes from Arthrobacter sp. Q36. 

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1289, 10-13. 

7. Maruta, K., Hattori, K., Nakada, T., Kubota, M., Sugimoto, T., Kurimoto, M. (1996). 

Cloning and Sequencing of Trehalose Biosynthesis Genes from Rhizobium sp. M-ll. 

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 60, 717-720. 

8. Maruta, K., Mitsuzumi, H., Nakada, T., Kubota, M., Chaen, H., Fukuda, S., Sugimoto, T., Kurimoto, M. (1996). Cloning and sequencing of a cluster of genes encoding novel enzymes of trehalose biosynthesis from thermophilic archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. Biochim Biophys Acta, 1291, 177-181.

Nguyễn Mạnh Đạt1*, Hà Minh Ngọc2, Nguyễn Thị Mai3, Đỗ Thị Thanh Huyền1, Bùi Thị Hồng Phương1

Nguyễn Thị Hồng Lĩnh1, Chu Thắng1, Đỗ Thị Thủy Lê1, Nguyễn Thị Thu1, Lê Đức Mạnh1

1Viện Công nghiệp Thực phẩm

2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

3Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

(Nguồn: Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Số 48 - Tháng 7/2022)